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Tipo de material : bachelorThesis
Título : Desarrollo de un sistema para tipificación de polimorfismos de nucleótido simple (snps) en el gen HIF-2a involucrados en la respuesta adaptativa a hipoxia por altura mediante Snapshot multiplex
Autor : Ruano Chávez, Miguel Mateo
Tutor : Rivas Romero, Fernando Xavier
Palabras clave : GENÉTICA;ADN;BIOTECNOLOGÍA
Fecha de publicación : 2017
Citación : Ruano Chávez, Miguel Mateo (2017). Desarrollo de un sistema para tipificación de polimorfismos de nucleótido simple (snps) en el gen HIF-2a involucrados en la respuesta adaptativa a hipoxia por altura mediante Snapshot multiplex. Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarías. UDLA. Quito. 103 p.
Resumen : El Factor Inducible por Hipoxia 2-α (HIF2-α) es el principal gen involucrado en la adaptación del organismo a condiciones de hipoxia. Este gen codifica para la segunda isoforma de la subunidad alfa del factor transcripcional HIF, que regula la expresión de más de 100 genes asociados a rutas metabólicas dependientes de oxígeno. SNPs en el gen HIF2-α, que afectan a la proteína (HIF2-α), se han relacionado con la regulación de la angiogénesis vascular, viscosidad de la sangre y proliferación de hepatocitos, desarrollo de células pancreáticas y placentarias; en enfermedades como isquemia retinal, hipertensión arterial y pulmonar e incluso procesos oncogénicos, como melanoma. La importancia de estudiar SNPs radica en que, dependiendo de su ubicación, tienen profundas implicaciones en el organismo. El método Gold Standard para la determinación de SNPs es la secuenciación fluoromarcada por el método Sanger. Sin embargo, tipificar SNPs por este método implica considerable inversión de dinero, tiempo e insumos, puesto que requiere secuenciar ambas hebras del fragmento de ADN. Con el objeto de superar estos inconvenientes, se propuso la tecnología SNaPshot®, que posibilita la genotipificación de hasta 20 SNPs, incluso en diferentes cromosomas, en una sola reacción de PCR Multiplex y corrida de electroforesis capilar. Es por esta razón que el principal objetivo del proyecto fue desarrollar el primer protocolo de tipificación que utilice el sistema SNaPshot® en el Ecuador, empleando como objeto de estudio el gen HIF2-α. Para cumplir con los objetivos del presente trabajo se diseñó un sistema basado en SNaPshot® para tipificar siete SNPs en el gen HIF2-α, mediante un par de primers y una sonda por SNP. De este modo, se usaron los ADN control comercial 9948M, 9947A, K562, C007, en base a los cuales se ajustaron las condiciones de la PCR y del juego de reactivos SNaPshot® Multiplex, finalmente, los resultados se validaron con el método Gold Standard. En base a la validación y al análisis de costos realizado, se concluyó que el sistema SNaPshot® Multiplex tiene la misma sensibilidad y especificidad que el método Gold Standard, pero es sumamente más económico, rápido y sencillo de implementarlo en el país.
Descripción : Hypoxia Inducible Factor 2-α (HIF2-α) is the leading gene involved in the adaptation of the organism to hypoxia conditions. This gene encodes for the second isoform of the alpha subunit of HIF transcriptional factor, which regulates the expression of more than 100 genes associated with oxygen dependent metabolic pathways. SNPs in the HIF2-α gene, affecting protein (HIF2-α), have been linked to the regulation of vascular angiogenesis, blood viscosity and hepatocyte proliferation, pancreatic and placental cell development; in diseases, such as retinal ischemia, arterial and pulmonary hypertension, and even oncogenic processes, such as melanoma. The importance of studying SNPs lies in the fact that, depending on their location, they have serious implications on the organism. The Gold Standard method for determination of SNPs is the fluorinated sequencing by the Sanger method. However, typing SNPs by this method involves considerable investment of money, time, and supplies, since it requires sequencing both strands of the DNA fragment. To overcome these drawbacks, SNaPshot® technology was proposed, which allows the genotyping of up to 20 SNPs, even on different chromosomes, in one Multiplex PCR reaction and capillary electrophoresis run. It is for this reason that the major aim of the project was to develop the first typing protocol using the SNaPshot® system in Ecuador, using the HIF2-α gene as an object of study. To fulfill the objectives of the present work, a SNaPshot®-based system was designed to typify seven SNPs in the HIF2-α gene, using a pair of primers and a probe per SNP. In this manner, the commercial control DNAs 9948M, 9947A, K562, C007, were used, based on which the conditions of the PCR and the SNaPshot® Multiplex Kit were adjusted, finally, the results were validated using the Gold Standard method. Based on validation and cost analysis, it was concluded that SNaPshot® Multiplex system has the same sensitivity and specificity as the Gold Standard method, but it is extremely economical, fast, and easy to implement in the country.
URI : http://dspace.udla.edu.ec/handle/33000/7442
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