Desarrollo de un sistema para tipificación de polimorfismos de nucleótido simple (snps) en el gen HIF-2a involucrados en la respuesta adaptativa a hipoxia por altura mediante Snapshot multiplex

Abstract

El Factor Inducible por Hipoxia 2 α, HIF2 α es el principal gen involucrado en la adaptación del organismo a condiciones de hipoxia. Este gen codifica para la segunda isoforma de la subunidad alfa del factor transcripcional HIF, que regula la expresión de más de 100 genes asociados con vías metabólicas dependientes de oxígeno. Los SNP en el gen HIF2 α, que afectan a la proteína HIF2 α, se han relacionado con la regulación de la angiogénesis vascular, la viscosidad sanguínea y la proliferación de hepatocitos, el desarrollo de células pancreáticas y placentarias, en enfermedades, como isquemia retiniana, hipertensión arterial y pulmonar, e incluso oncogénicas procesos, como el melanoma. La importancia del estudio de los SNP radica en que, dependiendo de su localización, tienen serias implicaciones en el organismo. El método Gold Standard para la determinación de SNPs es la secuenciación fluorada por el método de Sanger. Sin embargo, la tipificación de SNP por este método implica una inversión considerable de dinero, tiempo y suministros, ya que requiere la secuenciación de ambas cadenas del fragmento de ADN. Para superar estos inconvenientes, se propuso la tecnología SNaPshot, que permite el genotipado de hasta 20 SNP, incluso en diferentes cromosomas, en una sola reacción de PCR Multiplex y electroforesis capilar. Es por ello que el objetivo principal del proyecto fue desarrollar el primer protocolo de tipificación mediante el sistema SNaPshot en Ecuador, utilizando el gen HIF2 α como objeto de estudio. Para cumplir con los objetivos del presente trabajo, se diseñó un sistema basado en SNaPshot para tipificar siete SNPs en el gen HIF2 α, utilizando un par de cebadores y una sonda por SNP. De esta forma, se utilizaron los ADN control comerciales 9948M, 9947A, K562, C007, en base a los cuales se ajustaron las condiciones de la PCR y el SNaPshot Multiplex Kit, finalmente se validaron los resultados mediante el método Gold Standard. Con base en la validación y el análisis de costos, se concluyó que el sistema SNaPshot Multiplex tiene la misma sensibilidad y especificidad que el método Gold Standard, pero es extremadamente económico, rápido y fácil de implementar en el país.