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Tipo de material : bachelorThesis
Título : Identificación y diferenciación molecular por la técnica de la Reacción de la Cadena Polimerasa (PCR) múltiple de subgéneros de Leishmania (Viannia y Leishmania) en el Ecuador
Autor : Fonseca Carrera, David Alejandro
Tutor : Calvopiña Hinojosa, Segundo Manuel
Palabras clave : INGENIERÍA GENÉTICA;PROPIEDADES BIOLÓGICAS;PCR;ADN
Fecha de publicación : 2019
Editorial : Quito: Universidad de las Américas, 2019
Citación : Fonseca Carrera, D. A. (2019). Identificación y diferenciación molecular por la técnica de la Reacción de la Cadena Polimerasa (PCR) múltiple de subgéneros de Leishmania (Viannia y Leishmania) en el Ecuador (Tesis de pregrado). Universidad de las Américas, Quito.
Resumen : El protozoario del género Leishmania con varias especies ocasiona enfermedades denominadas leishmaniasis. El género Leishmania contiene dos subgéneros Leishmania y Viannia, que incluyen 21 especies patógenas para el hombre. En el Ecuador, se han identificado los 2 subgéneros con las especies L. mexicana, L. amazonensis y L. major (subgénero Leishmania); L. braziliensis, L. panamensis, L. guyanensis, L. naiffi y L. lainsoni (subgénero Viannia). Existe predominancia de especies de acuerdo a las regiones geográficas del país. Es conocido que diferentes subgéneros-especies determinan diferentes formas clínicas, así como diferencian el tratamiento y el pronóstico de la enfermedad. La técnica más usada para el diagnóstico de leishmaniasis es la identificación de las formas parasitarias amastigotes de Leishmania por microscopía de luz. Los métodos de caracterización e identificación de subgéneros y especies se basan en caracteres bioquímicos, inmunológicos y moleculares. Por microscopia es imposible diferenciar entre subgéneros debido a que estos organismos son morfológicamente idénticos. Las herramientas moleculares han demostrado utilidad para diagnosticar, caracterizar, tipificar, y cuantificar los agentes etiológicos. En la presente investigación, se ha realizado el diseño de una PCR múltiple con el propósito de diferenciar entre los subgéneros Leishmania y Viannia, se generó un análisis bioinformático mediante alineamientos múltiples de secuencias de marcadores moleculares con el fin de obtener secuencias consenso para los dos subgéneros. A partir de dicho análisis se determinó que los marcadores moleculares para la diferenciación fueron los genes cpb y nagA, coincidiendo con los reportes de otras investigaciones. Por medio de la selección de los genes, se procedió al diseño de cebadores discriminantes y posteriormente a la estandarización de una PCR múltiple. Como resultado, se obtuvo amplificaciones con los siguientes tamaños; una de 300 pb perteneciente a la amplificación parcial del gen nagA para la identificación del subgénero Leishmania y otro de 172 pb perteneciente a la amplificación parcial del gen cpb para la identificación del subgénero Viannia. Los resultados por PCR fueron respaldados por un análisis de secuenciación evidenciando la alta confiabilidad de la técnica. Ya estandarizada la técnica, se procedió a su aplicación en muestras humanas inmovilizadas en papel FTA provenientes de la Amazonía. La presente investigación permitirá la identificación precisa de los subgéneros en las lesiones de pacientes, así como la discriminación de vectores y reservorios. A futuro permitirá el desarrollo de otros proyectos enfocados a la distribución geográfica de dichos subgéneros.
Descripción : The protozoa parasite of the genus Leishmania produce high impact diseases named leishmaniases. Mainly, this genus contains 2 subgenus (Viannia and Leishmania) that have 21 pathogenic species for humans. In Ecuador, it has been detected the 2-subgenus presence with the species: L. mexicana, L. amazonensis and L. major (Leishmania subgenus); L. braziliensis, L. panamensis, L. guyanensis, L. naiffi and L. lainsoni (Viannia subgenus). There is a species predominance according to the geographical regions located in the country. It is known that many subgenus-species are closely related with the clinical manifestations in the affected patients as well as the disease’s forecast and the respective downstream treatment. For this disease diagnosis, the most used technique is light microscopy that identifies the Leishmania amastigotes forms. The microscopic technique has a huge disadvantage that is the inability for the differentiation of the subgenus and species, due to, there is no a morphological difference between them. In the case of the detection between subgenus and species in Leishmania, there are some biochemical, immunological and molecular characteristics that are mainly considered. Some molecular tools have been demonstrated to be useful for the diagnosis, characterization, typing and quantification of the etiological agents. In the present investigation, we designed a multiplex-PCR with the main objective to differentiate between the Leishmania and Viannia subgenus. To achieve this objective, we made a bioinformatics analysis that encompassed multiple sequences alignments from different molecular markers with the purpose of obtaining some consensus sequences for each subgenus. In base of this pre-analysis we determined that the cpb and nagA genes are optimum for the differentiation, coinciding with different studies asseverations. With the selection of gen, we designed some discriminant primers that allowed us to develop a downstream multiplex-PCR. As a result, we obtained some PCR products that have the following sizes; one 300 bp amplicon from the nagA gene for the Leishmania subgenus and a 172 pb amplicon from the cpb gene for the Viannia subgenus. The PCR results were confirmed by a later sequencing analysis that demonstrated a high reliability in the developed technique. The standardized technique was applied in immobilized human samples in FTA papers from the Ecuadorian amazon. The present investigation will allow the precise subgenus identification in different patient lesions, as well as the discrimination of reservoirs and vectors. In the future, this technique could help in the development of some projects that are directed to the study of the subgenus geographical distribution.
URI : http://dspace.udla.edu.ec/handle/33000/11044
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