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Tipo de material : bachelorThesis
Título : Desarrollo, estandarización y aplicación de la técnica molecular PCR en tiempo real para la detección y cuantificación de ADN del trematodo Amphimerus spp en metacercarias obtenidas de peces
Autor : Proaño Montenegro, María Belén
Tutor : Calvopiña Hinojosa, Segundo Manuel
Palabras clave : ENFERMEDADES INFECCIOSAS;PRUEBAS DE ADN;BIOTECNOLOGÍA;PECES
Fecha de publicación : 2019
Editorial : Quito: Universidad de las Américas, 2019
Citación : Proaño Montenegro, M. B. (2019) Desarrollo, estandarización y aplicación de la técnica molecular PCR en tiempo real para la detección y cuantificación de ADN del trematodo Amphimerus spp en metacercarias obtenidas de peces (Tesis de pregrado). Universidad de las Américas, Quito.
Resumen : La Organización Mundial de la Salud (OMS) considera a las trematodiasis como enfermedades tropicales olvidadas. En el Ecuador existen 3 trematodiasis que son prevalentes persistentes en zonas tropicales, paragonimiasis, fasciolasis y amphimeriasis. La amphimeriasis que fue recientemente y por primera vez descrita en Ecuador, es considerada una enfermedad emergente, infectando personas, gatos y perros en las provincias de Esmeraldas y Manabí. Amphimerus spp. se localiza aloja en las vías biliares de los infectados causando enfermedad. El ciclo de vida de Amphimerus requiere de 2 hospederos intermediarios; los primeros son invertebrados (caracoles de río) mientras que los segundos son varias especies de peces de agua dulce. La infección se produce por la ingestión de peces crudos o mal cocidos infectados con metacercarias del parásito. La identificación de las metacercarias en los peces se realiza por disección, digestión artificial y observación microscópica; sin embargo, la sensibilidad, especificidad y eficiencia se ven afectadas por esta técnica laboriosa. Por esta razón, se requiere del desarrollo de técnicas moleculares como la PCR en tiempo real (qPCR) para la identificación rápida y específica de ADN del Amphimerus en diferentes especies de peces en las zonas endémicas. En esta investigación se estandarizó una PCR en Tiempo Real usando cebadores diseñados in house dirigidas a la región ITS2 de Amphimerus, se estandarizó por medio de gradientes de temperatura de hibridación y denaturación; y variaciones en la concentración de cebadores. En el ciclo de umbral (Ct) resultante de cada variación no se encontró diferencias estadísticamente significativas; sin embargo, los parámetros seleccionados fueron los que contenían un menor Ct debido al mayor porcentaje de sensibilidad. Las curvas de calibrado obtenidas mantuvieron una eficiencia mayor al 90 por ciento y coeficiente de correlación (R2) mayor al 0.98, indicando que el nivel de confiabilidad de la técnica realizada es alto. La técnica identifica 1 metacercaria y concentración de ADN de 0,05 ng-μl. La especificidad se determinó comparando ADN de dos trematodos Paragonimus y Fasciola encontrando que los cebadores fueron específicos para Amphimerus. En experimentos con músculo de pez infectado se determinó que el peso o la cantidad de músculo afectan la detección ADN de Amphimerus. En conclusión, la técnica desarrollada de PCR en Tiempo Real demostró ser altamente sensitiva, específica y confiable en la detección del trematodo Amphimerus spp. En estado de metacercaria encontrados en peces. Esta técnica podría aplicarse para diferenciar las especies de peces portadoras del parasito, para así educar a las personas en riesgo en la prevención de la infección y tomar medidas de control/eliminación efectivas en la comunidad.
Descripción : The World Health Organization (WHO) considers trematode infections as neglected tropical diseases. In Ecuador there are 3 trematodiasis that are prevalent in tropical zones, paragonimiasis, fasciolasis and amphimeriasis Amphimeriasis was recently and for the first time described in Ecuador, considered an emerging disease, infecting people, cats and dogs in the provinces of Esmeraldas and Manabí. Amphimerus spp. is in the bile ducts of the infected causing disease. The life cycle of Amphimerus requires 2 intermediate hosts; the first ones are invertebrates (river snails) while the second ones are several species of freshwater fish. The infection is caused by the ingestion of raw or undercooked fish infected with metacercarie. The identification of metacercarie in fish is done by dissection, artificial digestion and microscopic observation; However, sensitivity, specificity and efficiency are affected by this laborious technique. For this reason, the development of molecular techniques such as real-time PCR (qPCR) is required for the rapid and specific identification of Amphimerus DNA in different fish species in endemic areas. In this research, a Real Time PCR was standardized using in house designed primers directed to the ITS2 region of Amphimerus, it was standardized by gradients of temperature of hybridization and denaturation; and variations in the concentration of primers. No statistically significant differences were found in the threshold cycle (Ct) resulting from each variation; however, the parameters selected were those that contained a lower Ct due to the higher percentage of sensitivity. The calibration curves obtained maintained an efficiency greater than 90 percent and a correlation coefficient (R2) greater than 0.98, indicating that the level of reliability of the technique performed is high. The technique identifies 1 metacercarie and a DNA concentration of 0.05 ng-μL. The specificity was determined by comparing DNA from two trematodes Paragonimus sp. and Fasciola sp., finding that the primers were specific for Amphimerus. In experiments with infected fish muscle, was determined that the weight or the amount of muscle affects the DNA detection of Amphimerus. In conclusion, the developed technique of Real Time PCR proved to be highly sensitive, specific and reliable in the detection of the trematode Amphimerus spp. in metacercarie state found in fish. This technique could be applied to differentiate and incriminate the species of fish carrying the parasite, in order to educate people at risk in the prevention of infection and take effective control-elimination measures in the community.
URI : http://dspace.udla.edu.ec/handle/33000/10875
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